| A、细菌 | | 1. 食源性致病菌的中通量快速筛查 | | 本项目采用实时荧光PCR结合探针熔解曲线技术，针对腹泻症候群的40种主要类型的食源性致病菌展开中通量的多重检测。主要检测与分型对象包括：大肠杆菌（ETEC、EPEC、EHEC、EIEC、EAEC），金黄色葡萄球菌（A~E型毒素基因），沙门杆菌（副伤寒甲沙门菌、副伤寒乙沙门菌、副伤寒丙沙门菌），单增李斯特菌，志贺菌，溶血性链球菌，副溶血弧菌等等。这些致病菌及其组合是导致大规模人群呕吐、腹泻的主要原因，因此有必要在事发之后迅速准确地检测出占主导地位的一种或几种致病菌，从而快速的找出污染源并确定感染范围，从而进一步有效地控制住病情。本项目开发的检测技术可以实现在4小时左右从粪便浸出液或呕吐物的初增培养物中检测出占主导地位的食源性致病菌类型，从而达到快速监控大规模人群呕吐、腹泻病情的目的。 | | | 2. 基于多位点熔解分型的食源性致病菌的进化分析与溯源 | | 在现代法医学中，人们常常利用DNA信息来确定或者排除犯罪嫌疑人。微生物法医学同样也可以使用类似的手段，通过检测相关菌株间分子变异，来确定特定的微生物物种或者某种病原体，并可用于推断某个分离株的来源、传播途径和与其他菌株的关系等方面。在此过程中，微生物的分型技术（如PFGE、RAPD、AFLP、MLST、VNTR、MLVA等）在获得病原菌特征信息方面发挥了重要作用，但大多数分型技术还存在重复性差和不同实验室间无法实现数据交换等缺陷。本项目的主要目标是针对各种不断发生的食源性致病菌，在对其流行病学和病原学进行深入研究的基础上，开发一种首次基于实时PCR方法的病原分型新技术——多位点熔解分型技术（Multi-Locus Melting Typing, MLMT），并建立相应的数据库。 目前已以霍乱弧菌为模型，建立了其基因组中8个看家基因位点的探针熔解曲线分型体系。通过对46株霍乱弧菌各个基因位点的熔解温度（Tm）比对，生成每个菌株的等位基因Tm图谱或称熔解类型（melting type, MT），即菌株的“指纹” ；根据菌株各自的等位基因Tm图谱使用配对差异矩阵（matrix of pair-wise differences）等方法构建系统树图，最终用于各组群菌株间的分型和基因组相关性分析。该技术同样可应用到多种真核和原核的致病微生物。总之，该技术分辨力高、重复性好、操作简便快速，有望成为一种高通量的新型分型技术，在网络实验室中获得广泛应用。 | | | 3. 结核分枝杆菌耐药突变快速诊断试剂盒的研制 | 结核病是一种严重危害人民身体健康的慢性传染病，在抗结核药物发现早期，不规则用药导致结核病耐药严重，而20世纪80年代以来由于贫困、艾滋病和人口流动的增加，导致结核病尤其是耐药结核病有“复燃”的趋势。本研究小组的主要研究目标和任务是，在目前已报道的结核分枝杆菌耐药相关突变位点的基础上，利用本实验室建立的高通量突变筛查技术，开发能够快速准确检测结核分枝杆菌耐药突变的诊断试剂，以期在获得菌株（或痰标本）后，可在2小时以内给出突变信息，只需一步操作，且完全闭管操作。本实验室建立的技术快速、灵敏度高、特异性好，且相比目前已有的商品化检测试剂成本较低，适用于大规模的临床筛查。目前已经进入生产工艺研究临床研究和报批阶段的耐药检测体系有利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素和氟喹诺酮，仍处于研发阶段的耐药检测体系有吡嗪酰胺及二线注射类药物。
目前已建立的技术平台：结核分枝杆菌耐药突变数据库 | | | 4. 实时荧光PCR快速检测临床病原菌β-内酰胺酶耐药基因 | | 当前医院感染病原菌的耐药问题日趋严重，尤其是β-内酰胺酶导致的临床病原菌的耐药性，该耐药性已给临床治疗感染性疾病带来极大困难，严重威胁医患人员的健康。本项目紧密跟踪国内外医院感染病原菌耐药性这一热点研究领域，针对当前临床耐药菌株检测遇到的困难和不足，探索在临床实验室建立一种对产β-内酰胺酶（如AmpC酶，金属酶，超广谱β-内酰胺酶等）耐药菌株进行快速检测的方法，而不是停留在表型检测的改进和普通PCR的研究。本项目利用实时荧光PCR技术，通过设计耐药基因特异性的改良分子信标探针，实现在临床对产β-内酰胺酶耐药菌株进行快速实时检测，不仅能为临床实验室耐药菌株检测研究提供技术方法，而且能为我国医院感染监测及防治提供科学依据，有效减缓和控制耐药菌株的产生。 | | | | | B 病毒 | | 1. 乙肝（HBV）耐药的快速诊断试剂盒的研制 | | 核苷类药物是临床上用于治疗乙肝病毒患者的主要药物，目前市面上主要的四种核苷类药物是拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦和替比夫定。虽然核苷类药物在控制乙肝病情上有着显著疗效，但是在长期服用过程中乙肝病毒会产生各种耐药突变，这些耐药突变会导致相应药物疗效的大幅度下降，并且不同的耐药突变导致的临床疗效下降幅度不同，这将直接关系到临床用药类型和用药剂量。本项目采用实时荧光PCR结合探针熔解曲线技术，针对乙肝病毒的主要耐药位点展开全方面的检测，不仅能够在2小时左右检测出血清中的病毒株是否产生了耐药突变，而且能够清楚地知道产生了何种耐药突变。因此，该快速、简便、低成本的乙肝耐药快速检测技术能够有效地用于指导临床用药。 | | | 2. 高致病性HPV病毒的快速诊断试剂盒研制 | | HPV病毒是引起子宫颈癌与生殖器疣的元凶，目前常见的黏膜型致病性HPV病毒有30种（高危型：16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82；潜在高危型：26、53、66；低危型：6、11、40、42、43、44、54、61、69、70、72、81），但是并不是所有HPV病毒都会高概率导致子宫颈癌，例如目前FDA认证通过的HPV病毒四价疫苗（Gardasil，Cervarix）只覆盖高危型的16型和18型以及低危型的6型和11型，因此在临床预防与治疗中有必要对患者感染的HPV病毒类型做出快速准确的诊断。本项目采用实时荧光PCR结合探针熔解曲线技术针对30种常见的HPV病毒进行分型，能够在4小时左右检测出患者宫颈表面黏膜是否带有以上30种中的一种或几种HPV病毒，达到了在临床预防和治疗过程中快速诊断的目的。 | | | | |
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